Welche Enzyme taugen, und warum die übrigen nicht

Was es tut

Sind Insert und Vektor geladen, bewertet das Werkzeug jedes Enzympaar der Klonierungsstelle und gibt pro Paar ein Urteil aus. Die tauglichen werden sortiert; die übrigen nennen den Grund samt genauer Position des Problems.

Für das gewählte Paar berechnet es die Primer (Klammer, Schnittstelle und Anlagerungsbereich), ihre beiden Schmelztemperaturen, das entstehende Plasmid mit neu platzierten Annotationen und das Gel, das bei der Kontrolle zu sehen sein sollte.

Gedacht ist es für den Schritt vor der Oligo-Bestellung: den Moment, in dem ein Planungsfehler noch keine Woche im Labor gekostet hat.

Wie es benutzt wird

• Das Gen wird aus einer Datei geladen (GenBank, FASTA, SnapGene .dna oder EMBL), durch Einfügen des Textes, über eine Zugangsnummer oder eine NCBI-Suche, oder aus den zehn zuletzt genutzten Sequenzen. Auch Hineinziehen genügtInsert
• Der Vektor wird genauso geladen. Eine FASTA-Datei gibt keine Topologie an: für den Vektor wird zirkulär angenommen, für das Insert linear, änderbar mit einem KlickVektor
• Die linke Spalte zeigt die Enzyme, die den Vektor genau einmal schneiden; der Reiter Enzymes jedes Paar mit seinem Urteil und dem Grund jeder AblehnungKandidaten
• Mit der Wahl eines Paares werden die Oligos, das fertige Plasmid und die Gelsimulation berechnetErgebnis
• Das Produkt als GenBank, die Primer als FASTA, Karten und Gel als PNG oder SVG. Jede Datei enthält einen Herkunftsblock: Werkzeug, Datum, Enzyme und BedingungenDownloads
• Die Oberfläche gibt es auf Englisch und Spanisch: Sie öffnet sich in der Sprache des Browsers und lässt sich mit der Schaltfläche EN/ES in der oberen Leiste umstellenSprache

Die Arbeit speichert sich selbst als Projekt im Browser und lässt sich als Datei herunterladen, um sie auf einem anderen Rechner zu öffnen. Die Focus-Schaltfläche verbirgt in jeder Ansicht die Seitenpanels, und die Karten lassen sich zoomen.

Was es prüft

Zehn Prüfungen, in dieser Reihenfolge, für jedes Enzympaar:

• Das Enzym schneidet im InsertAblehnung
• Das Enzym schneidet den Vektor nicht oder mehr als einmalAblehnung
• Die beiden Enden ligieren miteinander, sodass das Insert verkehrt eingebaut werden könnteAblehnung
• Eines der Enden ist glattWarnung
• Dasselbe Enzym auf beiden SeitenAblehnung
• Im Primer fehlen Klammerbasen vor der SchnittstelleWarnung
• Die Verbindung liegt außerhalb des Leserahmens oder führt ein Stoppcodon ein, wenn die Rahmenprüfung verlangt wirdAblehnung
• Die Nachbarbasen bilden eine Dam- oder Dcm-Stelle über der SchnittstelleWarnung
• Die beiden Vektorfragmente trennen sich im Gel nichtWarnung
• Wie viel Vektor zwischen den beiden Schnittstellen in dieser Reihenfolge verloren gehtHinweis

Wie es berechnet wird

• Schmelztemperatur nach nächsten Nachbarn, mit den vereinheitlichten Parametern von SantaLucia (1998) und deren Salzkorrektur. Magnesium wird mit der Näherung von von Ahsen (2001) in äquivalentes Natrium umgerechnetTm
• Zwei Temperaturen pro Primer: die des an die Matrize anlagernden Bereichs, die in den ersten Zyklen entscheidet, und die des gesamten Oligos. Die meisten Rechner geben nur die zweite anAnlagerung
• Dimere zwischen den beiden Primern in beiden Richtungen sowie das Selbstdimer jedes PrimersDimere
• Methylierung nach Kontext: berechnet wird, ob die Nachbarbasen dieser konkreten Sequenz eine Dam- oder Dcm-Stelle über der Schnittstelle bilden, wobei der intrinsische Fall von dem durch den Kontext erzeugten unterschieden wirdDam · Dcm
• Multiple Klonierungsstelle durch Berechnung gefunden — als der an einzigartigen Schnittstellen reiche Abschnitt, nicht am NamenMCS
• Gängige Elemente (ori, AmpR, KanR, die Promotoren lac, tac und CMV u. a.), erkannt per Alignment mit mindestens 90 % Identität24 Elemente
• Nebenannotationen eines Eintrags, etwa Phosphorylierungsstellen oder Interaktionsregionen, werden auf der Karte ausgeblendet, aber nicht gelöscht: Sie bleiben in den heruntergeladenen DateienAnnotationen
• Geprüfte Eingabe: was keine DNA ist, wird mit Begründung abgewiesen, und jede Änderung an einer Sequenz wird protokolliertEingabe

Die Gelsimulation

Es ist nicht nötig, vorher PCR und Verdau getrennt zu simulieren. Sobald ein Paar gewählt ist, kennt das Werkzeug Vektor, PCR-Produkt mit seinen Überhängen und das fertige Plasmid und baut daraus die Spuren: Vektor mit beiden Enzymen und mit jedem einzeln geschnitten, PCR-Produkt, fertiges Plasmid mit Doppelverdau und der 1-kb- oder 100-bp-Marker je nach Größen.

Die Banden werden linear in log(Größe) innerhalb des Auflösungsbereichs des jeweiligen Agarosegehalts platziert (Sambrook und Russell); was darüber hinausgeht, wird zur Tasche oder zur Lauffront hin gestaucht.

Die Intensität ist proportional zur Masse jedes Fragments; zwei Fragmente, die zusammen laufen würden, werden zu einer Bande zusammengefasst, und das wird angegeben. Ungeschnittene zirkuläre DNA wird nicht gezeichnet, weil ihre Position von ihrer Topologie und nicht nur von ihrer Größe abhängt.

Datenschutz

Berechnungen und Projekte von Genetics Lab werden in deinem Browser verarbeitet. Sequenzen und Projekte gehen nicht in die Nutzungsmessung ein. Bei der Abfrage öffentlicher Datensätze gelangen die Kennung oder die Suchbegriffe zu NCBI.

Projekte und die letzten Sequenzen liegen im lokalen Speicher des Browsers. Das Löschen der Websitedaten entfernt sie; lade deine Projekte herunter, um sie zu behalten. Datenschutz — Haldane Genomics.

Grenzen

• Nur Restriktionsklonierung und Ligation eines Inserts in einen Vektor. Gibson, Golden Gate, Gateway und In-Fusion sind nicht abgedecktUmfang
• Puffer, Star-Aktivität und die Methylierungsempfindlichkeit des einzelnen Enzyms bleiben unberücksichtigt: angegeben wird der Sequenzkontext, nicht das Verhalten einer kommerziellen ChargeReagenzien
• Das Gel ist eine Näherung: Teilverdau, superspiralisierte DNA und Unterschiede zwischen Elektrophoresepuffern werden nicht simuliertGel
• Die Bibliothek gängiger Elemente ist absichtlich klein. Was sie nicht erkennt, wird so gezeigt, wie es in der Datei annotiert istAnnotationen

Lizenz und Nutzung

Genetics Lab ist proprietäre Software von Haldane Genomics. Die Nutzung unter haldanegenomics.com/geneticslab ist kostenlos und erfordert keine Registrierung.

Die mit dem Werkzeug erzeugten Dateien, Karten und Bilder gehören denjenigen, die sie erzeugen, und dürfen ohne Einschränkung in Publikationen, Abschlussarbeiten, Berichten oder Lehrmaterial verwendet werden. Eine Zitierung des Werkzeugs wird geschätzt.

Der Quellcode ist nicht öffentlich. Es wird keine Lizenz erteilt, ihn ganz oder teilweise zu kopieren, zu verändern, weiterzugeben, anderswo zu hosten oder zurückzuentwickeln, ohne schriftliche Erlaubnis von Haldane Genomics. Die Software wird wie besehen bereitgestellt, ohne jede Gewährleistung.

Daten Dritter: Der Katalog mit 623 Enzymen stammt aus Bio.Restriction (Biopython) und wird unter der Biopython License Agreement weitergegeben. Die thermodynamischen Parameter sind veröffentlichte Konstanten. Karten von Addgene oder Tabellen von NEB sind nicht enthalten.

Wie man es zitiert

Für die Schmelztemperaturen sollte zusätzlich SantaLucia, J. (1998) zitiert werden: A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. PNAS 95(4):1460–1465; und für den Enzymkatalog Cock, P. J. A. et al. (2009). Biopython: freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics. Bioinformatics 25(11):1422–1423.

Fragen, Fehler oder ein konkretes Klonierungsprojekt: [email protected].