Qué enzimas sirven, y por qué no sirven las demás

Qué hace

Con un inserto y un vector cargados, la herramienta evalúa cada pareja de enzimas del sitio de clonación y devuelve un veredicto por pareja. Las que funcionan se ordenan; las que no, llevan escrito el motivo, con la posición exacta del problema.

Con la pareja elegida calcula los cebadores (pinza, diana y zona de anillamiento), sus dos temperaturas de fusión, el plásmido resultante con sus anotaciones recolocadas y el gel que debería verse al comprobarlo.

Está pensada para el paso previo a pedir los oligos: el momento en el que un error de diseño todavía no ha costado una semana de laboratorio.

Cómo se usa

• El gen se carga desde un archivo (GenBank, FASTA, SnapGene .dna o EMBL), pegando el texto, con un número de acceso o una búsqueda en NCBI, o desde las diez últimas secuencias usadas. También basta con soltarlo encimainserto
• El vector se carga igual. Un FASTA no declara topología: se asume circular para el vector y lineal para el inserto, y se puede cambiar con un clicvector
• La columna izquierda muestra las enzimas que cortan una sola vez el vector; la pestaña Enzymes, cada pareja con su veredicto y el motivo de cada descartecandidatas
• Al elegir una pareja se calculan los oligos, el plásmido final y la simulación del gelresultado
• El producto en GenBank, los cebadores en FASTA, y los mapas y el gel en PNG o SVG. Cada archivo lleva un bloque de procedencia: herramienta, fecha, enzimas y condicionesdescargas
• La interfaz está en español y en inglés: se abre en el idioma del navegador y se cambia con el botón EN/ES de la barra superioridioma

El trabajo se guarda solo, como proyecto, en el propio navegador, y se puede descargar como archivo para abrirlo en otro equipo. El botón Focus oculta los paneles laterales en cualquier vista, y los mapas admiten zoom.

Qué comprueba

Diez comprobaciones, en este orden, sobre cada pareja de enzimas:

• La enzima corta dentro del insertodescarta
• La enzima no corta el vector, o lo corta más de una vezdescarta
• Los dos extremos ligan entre sí, de modo que el inserto podría entrar al revésdescarta
• Uno de los extremos es romoaviso
• La misma enzima en los dos ladosdescarta
• Faltan bases de pinza delante de la diana en el cebadoraviso
• La unión queda fuera de marco o introduce un codón de parada, cuando se pide comprobar el marcodescarta
• Las bases vecinas forman un sitio Dam o Dcm sobre la dianaaviso
• Los dos fragmentos del vector no se separan en un gelaviso
• Cuánto vector se pierde entre las dos dianas en ese ordeninformativo

Cómo está calculado

• Temperatura de fusión por vecinos más próximos, con los parámetros unificados de SantaLucia (1998) y su corrección salina. El magnesio se convierte a sodio equivalente con la aproximación de von Ahsen (2001)Tm
• Dos temperaturas por cebador: la de la zona que hibrida con el molde, que es la que manda en los primeros ciclos, y la del oligo completo. La mayoría de calculadoras solo da la segundaanillamiento
• Dímeros entre los dos cebadores en ambos sentidos, y el autodímero de cada unodímeros
• Metilación por contexto: se calcula si las bases vecinas de esa secuencia concreta forman un sitio Dam o Dcm sobre la diana, y se distingue el caso intrínseco del que crea el contextoDam · Dcm
• Sitio de clonación múltiple detectado por cálculo, como el tramo enriquecido en dianas únicas, no por su nombreMCS
• Elementos comunes (ori, AmpR, KanR, promotores lac, tac y CMV, entre otros) reconocidos por alineamiento con una identidad mínima del 90 %24 elementos
• Anotaciones secundarias de un registro, como sitios de fosforilación o regiones de interacción, ocultas en el mapa pero no borradas: siguen en los archivos que se descargananotaciones
• Entrada revisada: lo que no es ADN se rechaza con el motivo, y cada cambio sobre una secuencia queda anotadoentrada

La simulación del gel

No hace falta simular antes una PCR y una digestión por separado. En cuanto hay una pareja elegida, la herramienta ya conoce el vector, el producto de PCR con sus colas y el plásmido final, y con ellos arma los carriles: vector cortado con las dos enzimas y con cada una por separado, producto de PCR, plásmido final con la doble digestión y la escalera de 1 kb o de 100 pb según los tamaños.

Las bandas se colocan de forma lineal en log(tamaño) dentro del intervalo de resolución de cada porcentaje de agarosa (Sambrook y Russell), y lo que queda fuera se comprime hacia el pocillo o hacia el frente.

La intensidad es proporcional a la masa de cada fragmento; dos fragmentos que migrarían juntos se funden en una sola banda, y se indica. El ADN circular sin cortar no se dibuja, porque su posición depende de su topología y no solo de su tamaño.

Privacidad

Los cálculos y proyectos de Genetics Lab se procesan en tu navegador. Las secuencias y proyectos no se incluyen en las mediciones de navegación. Al consultar registros públicos, el identificador o los términos de búsqueda viajan a NCBI.

Los proyectos y las últimas secuencias se guardan en el almacenamiento local del navegador. Borrar los datos del sitio los elimina; descarga tus proyectos para conservarlos. Privacidad — Haldane Genomics.

Límites

• Solo clonación por restricción y ligación de un inserto en un vector. No cubre Gibson, Golden Gate, Gateway ni In-Fusionalcance
• No considera tampones, actividad estrella ni la sensibilidad de cada enzima a la metilación: indica el contexto de secuencia, no el comportamiento de un lote comercialreactivos
• El gel es una aproximación: no simula digestiones parciales, ADN superenrollado ni diferencias entre tampones de electroforesisgel
• La biblioteca de elementos comunes es pequeña a propósito. Lo que no reconoce se muestra tal como viene anotado en el archivoanotaciones

Licencia y uso

Genetics Lab es software propietario de Haldane Genomics. Su uso en haldane.omegadym.com/geneticslab es gratuito y no requiere registro.

Los archivos, mapas e imágenes que se generan con la herramienta pertenecen a quien los genera y pueden usarse sin restricción en publicaciones, tesis, informes o material docente. Se agradece citar la herramienta.

El código fuente no es público. No se concede licencia para copiarlo, modificarlo, redistribuirlo, alojarlo en otro sitio ni someterlo a ingeniería inversa, total o parcialmente, sin permiso escrito de Haldane Genomics. El software se ofrece tal cual, sin garantía de ningún tipo.

Datos de terceros: el catálogo de 623 enzimas procede de Bio.Restriction (Biopython) y se distribuye bajo la Biopython License Agreement. Los parámetros termodinámicos son constantes publicadas. No se incluyen mapas de Addgene ni tablas de NEB.

Cómo citarla

Para las temperaturas de fusión corresponde citar también a SantaLucia, J. (1998). A unified view of polymer, dumbbell, and oligonucleotide DNA nearest-neighbor thermodynamics. PNAS 95(4):1460–1465; y, para el catálogo de enzimas, a Cock, P. J. A. et al. (2009). Biopython: freely available Python tools for computational molecular biology and bioinformatics. Bioinformatics 25(11):1422–1423.

Consultas, errores o un caso de clonación concreto: [email protected].